Métodos en Biología Celular
Fluorocromos | Microscopio de fluorescencia | Microscopio de fluorescencia confocal | LSC
Los fluorocromos son sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotón de una longitud de onda determinada cuando captan (son exitados) por un fotón incidente de una longitud de onda característica. Por ejemplo, el isotiocianato de fluoresceína tiene un máximo de absorción a 490 nm y un máximo de emisión a 520 nm.
Puedes obtener información sobre los fluorocromos en las webs de las empresas principales del área : Bio-Rad, Leica, Hitachi, Olympus, etc... y dispones de un listado excepcional en la colección de espectros de Molecular Probes.
| Uno de los problemas de la utilización de fluorocromos en microscopía de fluorescencia es la pérdida de ésta debido a las grandes intensidades de luz empleadas. Las muestras empleadas en esta técnica no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a la desaparición de la fluorescencia ('fluorescence fading'). Una muestra que ha perdido parte de la fluorescencia presenta regiones 'oscuras' (como en el ejemplo). Se han desarrollado métodos que permiten reducir este efecto, entre ellos destacan : | |
el uso de reactivos protectores de la fluorescencia ('antifading reagents')
el uso de fluorocromos con poco 'fading'
el empleo de luz de excitación de menor intensidad
la reducción de la concentración de oxígeno en el especimen
el direccionamiento del 100% de la luz hacia el dispositivo de registro (cámara, película,...) para reducir al máximo el tiempo de exposición.
el empleo de mecanismos de medición de la exposición óptima (automática) para reducir la iluminación al máximo.
Los reactivos 'antifading' son moléculas que aportan al fluorocromo aquellos electrones que ha perdido por la emisión fluorescente. Se trata de moléculas donadoras de electrones que deben encontrarse para ser efectivas en estrecha vecindad a las moléculas de fluorocromo. Además son específicas de fluorocromo pues los electrones que pueden donar sólo serán donables si se encuentran en niveles de energía ligeramente superiores a los propios del fluorocromo en reposo. A continuación se muestran dos esquemas en los que se aprecia el efecto protector de dos 'antifading' sobre dos fluorocromos.
| Estabilidad de la fluorescencia de la fluoresceína (FITC) medida sobre preparaciones de PtK2 en las que se han detectado citokeratinas con FITC con y sin P-phenylenediamine. |
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| Estabilidad de la fluorescencia de la rodamina (TRITC) medida sobre preparaciones de PtK2 en las que se han detectado microfilamentos con faloidina-TRITC con y sin n-propyl galeato. |
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Los reactivos antifading más empleados son los siguientes :
p-phenylenediamine. Es el reactivo más efectivo para la conservación de la fluorescencia de la fluoresceína (FITC). También efectivo para la rodamina. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS. El reactivo se tiñe de blanco cuando se expone a la luz. Se ha de conservar en la oscuridad. El contacto con la piel es extremadamente peligroso.
DABCO (1,4-diazabiccyclo-2,2,2-octane). Muy efectivo para la fluoresceína, aunque menor que la p-phenylenediamine. Es menos sensible a la luz y es mucho menos tóxico. Molecular Probes presenta una preparación (SlowFade).
n-propyl galeate. Es el agente más efectivo para la rodamina, aunque también es efectivo para la fluoresceína. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS.
2-mercaptoethylamine. Se emplea para la observación de cromosomas y muestras de DNA teñinas con ioduro de propidio (PI), naranja de acridina (AO) o cromomysin A3. Se emplea al 0.1 mM en Tris-EDTA.
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Material docente diseñado y elaborado por Manuel Reina. Última actualización : 15/09/2003 17:38 . Comentarios : mreina@ub.edu
